翻訳日：2020/09/12
原文：Humoral Immune Response to SARS-CoV-2 in Iceland.
概要
背景
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）の感染に対する体液性免疫反応の性質と持続性についてはほとんど知られていません。
方法
6つのアッセイ（2つのpan-免疫グロブリン[pan-Ig]アッセイを含む）を使用して、アイスランドの30,576人の血清サンプルの抗体を測定し、血清陽性の適切な測定値が両方のpan-Igアッセイで陽性であると判断しました。定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）アッセイによる診断後4ヶ月までの1237人から収集された2102サンプルを検査しました。SARS-CoV-2に曝露されていた4222人の隔離された人と、曝露されたことが知られていない23,452人の抗体を測定しました。
結果
SARS-CoV-2感染から回復した1797人のうち、検査を受けた1215人のうち1107人（91.1％）が血清陽性でした。2つのpan-Igアッセイによって分析された抗ウイルス抗体力価は、qPCRによる診断後2か月の間に増加し、残りの研究の間、プラトーにとどまりました。隔離された人の2.3％が血清陽性でした。曝露が不明な人のうち、0.3％が陽性でした。アイスランド人の0.9％がSARS-CoV-2に感染しており、0.3％で致命的であったと推定しています。また、アイスランドのすべてのSARS-CoV-2感染症の56％はqPCRで診断され、14％はqPCRで検査されていない（または検査された場合に陽性結果が得られなかった）隔離された人で発生したと推定しています。また、30％は隔離されていない人で発生し、qPCRで検査されていませんでした。
結論
我々の結果は、SARS-CoV-2に対する抗ウイルス抗体が診断後4か月以内に低下しなかったことを示しています。感染による死亡のリスクは0.3％であり、アイスランドでSARS-CoV-2に感染した人の44％はqPCRで診断されなかったと推定します。
2019年12月に重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）が原因でコロナウイルス感染症2019（Covid-19）が発生しました。Covid-19のほとんどの患者の血清変換は診断後7〜14日で発生します。スペインの61,000人のうち、人口の5％がスパイクと核タンパク質に対する抗体を形成しており、感染者の約3分の1が無症候性であることが示されました。感染者のかなりの部分が回復期の早い段階で抗体陰性になることが示唆されました。いくつかの研究では、重症患者では、症状がないか軽度の患者よりもSARS-CoV-2抗体の有病率とレベルが高いことが報告されています。
SARS-CoV-2の感染による死亡リスクは、診断された症例と診断されていない症例の総数が分母として必要となるため、推定が困難です。 感染症の死亡リスクは、カーニバルの祭りの後、ドイツの小さな町で0.4％、ダイヤモンドプリンセスクルーズ船で0.6％、中国で0.66％と報告されました。
SARS-CoV-2の十分に検証された血清学的アッセイが緊急に必要です。 市販のSARS-CoV-2抗体アッセイのいくつかの小規模な比較研究が発表されています。アイスランドのように血清有病率が低い集団をスクリーニングするには、非常に特異的なアッセイが必要です。
アイスランドでのSARS-CoV-2感染の最初の症例は2020年2月28日に確認され、4月30日までに流行は大幅に後退しました。この期間中、1797症例は定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）で診断され、4月30日から6月15日までに診断された13の新しい症例とは対照的でした。アイスランドではqPCRによる検査が広範囲に行われています。人口の15％（54,436人）が6月15日までにqPCRで検査されました
この研究の目的は、アイスランドの人口におけるSARS-CoV-2血清有病率を評価し、SARS-CoV-2感染後の最初の4か月以内の抗体レベルの長期的変化と、変化が既存の性別、年齢、表現型、およびCovid-19症状とどのように相関するかを評価することでした。我々は、6つの異なるアッセイを使用して、qPCR陽性者の2つのグループと、qPCRで検査されていない、または検査されて陰性の結果を受けた6つのグループのSARS-Cov-2反応性血清抗体をスクリーニングしました（図1; 補足付録1の表S1およびS2、NEJM.orgでこの記事の全文を入手できます）。
図1.調査で使用された8つのサンプルグループの概略図
上部のボックスには8つのサンプルグループが表示され、上部のボックス内の矢印は各サンプルコレクションの主なユーティリティを示します。下の2つのボックスは、使用された6つのアッセイを示しています。ボックスの外側の矢印は、2つの収集タイプに使用されたアッセイを示しています（定量的PCR法では陽性ではなく[非qPCR陽性]とqPCR陽性）。ヘルスケアグループの場合、サンプルはヘルスケアシステムへの訪問中に取得されました。検疫グループの場合、すべてのサンプルは検疫の完了時に取得されました。 qPCR陽性をテストした人からのサンプルの2つのグループは、疾患の経過中に異なる時間に取得されました。入院グループは入院中に取得されたサンプルで構成され、回復グループは回復後に取得されたサンプルで構成されます。 ECLIAは、電気化学発光免疫測定法、およびELISA酵素結合免疫吸着測定法を示します。
方法
倫理的配慮
研究はアイスランドの国立生命倫理委員会によって承認されました。ヘルスケアサンプルの収集は、アイスランドの保健当局に代わって、健康の安全保障と伝染病に関する1997年No.19に同意して実施されました。他のサンプルコレクションの一部であった参加者は、書面によるインフォームドコンセントを行いました。
抗体測定
核タンパク質（N）（Roche）に対するpan-免疫グロブリン（pan-Ig：IgM、IgG、およびIgA）抗体を対象とした6つの確立されたアッセイで、最大30,576人のSARS-CoV-2特異的抗体を測定しました。スパイクタンパク質のS1サブユニットの受容体結合ドメイン（RBD）に対するpan-Ig抗体（pan-Ig抗S1-RBD）（Wantai）; Nに対するIgMおよびIgG抗体（IgM抗NおよびIgG抗N）（EDI /Eagle）; スパイクタンパク質のS1サブユニットに対するIgGおよびIgA（IgG抗S1およびIgA抗S1）（Euroimmun）。陽性の閾値はアッセイメーカーから提供されました。2つのpan-Ig抗体アッセイを使用して血清有病率を評価しました。検査結果が陽性と見なされるには、両方のアッセイで陽性の結果が必要です（補足付録1の図S1）。qPCR陽性者間の抗体レベルを定量化するために、IgG抗N、IgM抗N、IgG抗S1、およびIgA抗S1を使用して、SARS-CoV-2に対する抗体を分析しました。
サンプル採集
qPCR陽性のアイスランド人の2つのグループと、qPCR検査を受けていない、または検査を受けて陰性の結果が得られた6つのグループで抗体を測定しました（図1）。入院中のqPCR陽性者のグループからサンプルを収集し、感染から回復したすべてのqPCR陽性者にサンプルを寄付するよう依頼しました。回復直後と回復後約3か月後（サンプル1237人の合計2102サンプル）。パンデミック前（2017年と2020年初頭）に収集された2つのサンプルグループを使用して、アッセイの特異性を評価し、パンデミックがアイスランドに到達した時期を特定しました。検疫中の感染と、感染の可能性に対する曝露の種類の影響を評価するためにqPCR陽性を検査していない検疫対象者からサンプルを収集しました。我々は、qPCR陽性の検査も検疫もされていない人から収集した3つのグループのサンプルを使用して、検疫外の血清有病率とアイスランドでのウイルスの広がりを評価しました（ヘルスケア、レイキャヴィーク、およびベストマンナエヤルのサンプルグループ、合計23,452人）。
感染率の推定
これらの6つのグループの中で最大のものであるヘルスケアグループは、高齢者向けに充実したものでした。血清有病率を推定するために、このサンプルに地域、性別、人口の年齢で重み付けしました（補足1を参照してください）。感染したアイスランド人の数を推定するために、qPCR陽性の人の数、隔離された人の数にこのグループの推定血清有病率を掛け、検疫外の人の数に検疫外の推定血清有病率を掛けました。感染者の数をアイスランド人の数で割ることにより、感染したアイスランド人の割合を推定しました。Covid-19による死亡数を感染者数で割ることにより、感染による死亡リスクを推定しました。
抗体レベル、年齢、性別、および臨床的特徴
年齢、性別、基礎疾患（27の表現型）、および臨床結果（35の特性）と回復力のあるグループから得られた最新のサンプルの抗体価（6つのアッセイのそれぞれについて）の関連性を検査しました。分析では、明確な臨床的特徴を序数で再記録しました。
統計分析
推定フラクションが0または1のときにClopper-Pearson法でフラクションの信頼区間を計算して、尤度比法を使用しました。各臨床特性と抗体レベルの間の関連を検査するために、表現型を共変量として多重回帰分析を行い、四分位数は応答として正規化された抗体レベルであり、年齢、年齢の二乗、性別、qPCR診断からの経過時間を調整し、年齢と性別との関連性を検査するときに年齢と性別の共変量をそれぞれ除外します。レベルをランク付けして変換することにより、ランクを1で割った値の逆正規変換と観測数を使用して、抗体レベルを四分位正規化しました。効果の推定値は、抗体レベルの標準偏差に関して報告されました。重回帰によって推定された標準誤差からP値と信頼区間を導き出しました。ボンフェローニ補正を使用して、有意性を決定しました。有意性のしきい値はP <[0.05÷6（2 + 27 + 35）] = 0.00013です。隔離された人の感染確率に対する曝露タイプの影響については、ロジスティック回帰を使用してオッズ比の信頼区間を推定しました。複数の検査の信頼区間は調整しませんでした。
結果
SARS-CoV-2抗体アッセイの特異性
pan-Ig抗体を測定する両方のアッセイは、2017年に収集されたサンプル間で偽陽性の数が少なかったです：472のサンプル間で2つのアッセイの偽陽性は0と1であり、単一のIgM抗NおよびIgG抗Nアッセイ（表S3）で得られたものと比較して良い結果です。アイスランドではSARS-CoV-2感染の有病率が低いため、サンプルが血清陽性と見なされるには、両方のpan-Ig抗体アッセイからの陽性結果が必要でした（補足付録1の補足法を参照してください）。2020年初頭のグループで収集されたサンプルはいずれも血清陽性ではありませんでした。これは、ウイルスが2020年2月までにアイスランドで広く拡散していなかったことを示しています。
qPCR陽性者におけるSARS-CoV-2抗体
qPCRによる診断から25日後、回復した人からのサンプルの90％以上が両方のpan-Ig抗体アッセイで陽性を示し、陽性を示した人の割合はその後も安定したままでした（図2および図S2）。入院中の人は、病院に入院していない人よりもqPCR診断後により頻繁かつ迅速に血清転換しました（図2および図S3）。回復した1215人（複数のサンプルがあった人からの最新のサンプルの結果に基づく）のうち、1107人が血清陽性でした（91.1％; 95％信頼区間[CI]、89.4〜92.6）（表1および表S4）。一部の診断は偽陽性のqPCR結果に基づいて行われた可能性があるため、91.1％は回復した人のSARS-CoV-2抗体を検出するための結合pan-Ig検査の感度の下限を表すと判断しました。
図2. qPCRによる診断以降の時間の関数としてのqPCR陽性症例の抗体保有率と力価
示されているのは、pan-Ig抗体アッセイと抗体価の両方で陽性のサンプルの割合です。赤は入院中の人のサンプルの数またはパーセンテージ（48人の249サンプル）を示し、青は回復が判定された後の人のサンプルの数またはパーセンテージ（1215人の1853サンプル）を示します。縦棒は95％信頼区間を示します。破線は、陽性と判定される検査のしきい値を示しています。ODは、光学密度、およびRBD受容体結合ドメインを示します。
表1. 2つのpan-Ig抗体アッセイで測定された、サンプル収集によるSARS-CoV-2抗体の有病率
2つ以上のサンプルを持つ487人の回復した人のうち、19人（4％）は異なる時点で異なるpan-Ig抗体検査結果を示しました（表2および図S4）。両方のpan-Ig抗体が陰性であった早期サンプルの22人のうち、19人が直近の検査日でも陰性であったことは注目に値します（ここでも、両方の抗体について）。1人は、最初の検査で両方のpan-Ig抗体が陽性であり、最新の検査で両方が陰性でした。
表2.回復したqPCR診断を受けた人の間で繰り返されたpan-Ig抗体検査の結果
回復した人の抗体レベルの長期的な変化は、横断的結果と一致していました（図S5）。抗体レベルは、抗体が2つのpan-Igアッセイで測定された場合、最初のサンプルよりも最後のサンプルの方が高く、IgG抗NおよびIgG抗S1アッセイで測定された場合、最初のサンプルよりもわずかに低く、大幅に低かった IgM抗NおよびIgA抗S1アッセイで測定した場合、最初のサンプルよりもかなり低かったです。
IgG抗N、IgM抗N、IgG抗S1、およびIgA抗S1抗体レベルは、qPCR陽性者間で相関していました（図S5およびS6および表S5）。両方のpan-Ig抗体アッセイで測定された抗体レベルは、qPCR診断後の最初の2か月間で増加し、次の2か月間はプラトーに留まりました。IgM抗N抗体レベルは診断後すぐに急速に上昇し、その後急速に低下し、通常2か月後には検出されませんでした。IgA抗S1抗体は、診断後1か月で減少し、その後も検出可能でした。IgG抗Nおよび抗S1抗体レベルは、診断後最初の6週間で増加し、その後わずかに減少しました。
隔離におけるSARS-CoV-2感染
SARS-CoV-2感染がqPCRで診断されたとき、1797のqPCR陽性のアイスランド人のうち、1088人（61％）が隔離されていました。qPCR陽性を検査していない（qPCRによって陰性の結果が出た、または単に検査されていない）4222人の隔離対象者の間で抗体を検査しました。これらの4222人の隔離者のうち、97人（2.3％、95％CI、1.9〜2.8）は血清陽性でした（表1）。家庭での曝露のある人は、他のタイプの曝露のある人よりも血清陽性である可能性が5.2（95％CI、3.3〜8.0）倍高かったです（表3）。同様に、家庭内曝露のある人のqPCRによる陽性結果は、他の種類の曝露のある人よりも5.2（95％CI、4.5〜6.1）倍高い可能性がありました。これらの2つの結果（qPCR陽性および血清陽性）を組み合わせると、家族より曝露した隔離された人の26.6％および家族に曝露されていない隔離された人の5.0％が感染したと計算されました。隔離中に症状があった人は、症状のない人よりも血清陽性である可能性が3.2（95％CI、1.7〜6.2）倍、qPCRで陽性となる可能性が18.2倍（95％CI、14.8〜22.4）でした。
表3.曝露の種類と症状の有無に応じた隔離対象者間のSARS-CoV-2感染
また、クラスターのアウトブレイクの影響を受けたアイスランドの2つの地域の人々を検査しました。VestfirdirのSARS-CoV-2クラスターでは、1.4％の居住者がqPCR陽性で、10％の居住者が隔離されました。隔離外のqPCRで検査されていない（または検査で陰性であった）326人は血清陽性ではありませんでした。Vestmannaeyjarのクラスターでは、居住者の2.3％がqPCR陽性で、居住者の13％が隔離されました。qPCR陽性の結果を受け取っていない447人の隔離された人のうち、4人が血清陽性でした（0.9％; 95％CI、0.3〜2.1）。Vestmannaeyjarの隔離外の663人のうち、3例は血清陽性でした（0.5％; 95％CI、0.1〜0.2％）。
アイスランドのSARS-CoV-2血清有病率
2020年2月18日から3月9日の間に470人の健康なアイスランド人から収集された血清サンプルはいずれも、pan-Ig抗体の両方に陽性はなく、pan-Ig抗Nアッセイでは4件は陽性でしたが（0.9％）、ウイルスは3月9日より前にアイスランドに広がっていなかったことが示されます。
Covid-19以外の理由でアイスランドのヘルスケアシステムとの接触を通じてSARS-CoV-2抗体について検査された18,609人のうち、39人は両方のpan-Ig抗体アッセイで陽性でした（居住地、性別、10歳の年齢カテゴリに基づいてサンプルに重み付けすることにより血清有病率を推定、0.3％、95％CI、0.2〜0.4）。隔離された人々の割合にほぼ比例するアイスランド全体のqPCR陽性者の割合には地域差がありました（表S6）。ただし、qPCR陽性および隔離対象者を除外した後、SARS-CoV-2抗体について陽性と判定された人の割合は、qPCRで陽性と判定された者の割合とは相関しませんでした。レイキャビクからの無作為サンプル収集における推定血清有病率（0.4％; 95％CI、0.3〜0.6）は、ヘルスケアグループ（0.3％; 95％CI、0.2〜0.4）と同様でした（表S6）。
アイスランドの住民の0.5％がqPCRで陽性反応を示したと計算します。隔離された人のSARS-CoV-2血清転換を伴う2.3％は、アイスランドの居住者の0.1％と推定します。この発見とヘルスケアグループの血清有病率に基づいて、アイスランドの人口の0.9％（95％CI、0.8〜0.9）がSARS-CoV-2に感染していると推定します。したがって、すべてのSARS-CoV-2感染の約56％がqPCRで診断され、14％がqPCRで診断されずに隔離で発生し、残りの30％が隔離外で発生し、qPCRで検出されませんでした。
アイスランドでのCovid-19による死亡
アイスランドでは、10人の死亡がCovid-19によるものであり、これは全国で10万人あたり3人の死亡に相当します。qPCR陽性症例のうち、0.6％（95％CI、0.3〜1.0）は致命的でした。ただし、分母としてアイスランドでのSARS-CoV-2感染の0.9％の有病率を使用して、0.3％（95％CI、0.2〜0.6）の感染死亡リスクを計算します。年齢で分類すると、70歳以下（0.1％、95％CI、0.0〜0.3）の方が70歳以上（4.4％、95％CI、1.9〜8.4）よりも感染症の死亡リスクが大幅に低かったです（表S7）。
年齢、性別、臨床的特徴、および抗体レベル
SARS-CoV-2抗体レベルは、高齢者と入院患者で高かったです（表4と表S8 [補足付録1で説明されていて、補足付録2で利用可能です]）。Pan-Ig抗S1-RBDおよびIgA抗S1レベルは、女性の方が低かったです。既存の条件のうち、複数のテストの調整後に、ボディマスインデックス、喫煙状態、および抗炎症薬の使用がSARS-CoV-2抗体レベルと関連していることがわかりました。ボディマスインデックスは抗体レベルと正の相関がありました。喫煙者と抗炎症薬の利用者は、抗体レベルが低かったです。臨床的特徴に関して、抗体レベルは入院および臨床的重症度と最も強く関連しており、発熱、最高体温測定値、咳、および食欲不振などの臨床症状がそれに続きました。エネルギー損失を除いて、これらの個々の症状の重症度は、より高い抗体レベルと関連していました。
表4.回復した人の、SARS-CoV-2抗体レベルと既存の状態およびCovid-19重症度の関連性
討論
SARS-CoV-2パンデミックの最初の波の間に、アイスランドでの感染の発生率は0.9％（95％CI、0.8〜0.9）であり、感染の致死リスクは0.3％（95％CI、0.2〜0.6）であったと推定します。感染による死亡リスクの推定値は、他の報告で説明している推定値より低いですが、一致しています。感染者のうち、56％は以前qPCRで診断された症例であり、14％が隔離されていて（qPCR検査を受けていないか、検査で陰性）、および30％はqPCR陽性であるとは知られておらず、隔離もされていませんでした。したがって、qPCRによる広範なスクリーニングにもかかわらず、感染のかなりの部分は検出されなかったと結論付けました。これは、多くの感染者が実質的な症状がなかったことを示しています。
死亡リスクは簡単に推定できますが、国や時期によって異なる場合があります。感染による死亡リスクの正確な計算には、診断されたものと診断されていないものの両方の感染数の正確な推定が必要です。アイスランドでは、他の国と比較してqPCRを通じて特定された感染の割合が高い（56％）（たとえば、スペインでは約9％）ので、感染の総数は相応に正確に推定されます。
使用した各pan-Ig SARS-CoV-2抗体アッセイは高い特異性（メーカーの文献によると99.8％）を持っているため、単一のpan-Igアッセイを使用するだけで十分かという疑問が生じます。2017年に得られた1つのサンプルは、1つのpan-Ig抗体アッセイでのみ陽性でした。これは、アイスランドのように感染率が1％未満の場合、2つの個別のアッセイを使用して血清有病率を決定することを支持する結果です。
4月30日までに、合計20,766人のアイスランド人が隔離されました。qPCRで陽性と判定された1797人のアイスランド人のうち、1088人（61％）が隔離されました。隔離対象者のかなりのqPCR検査にもかかわらず、qPCR陽性の結果を受けなかった（例えば、感染の診断）隔離対象者の2.3％がSARS-CoV-2抗体を発生しました。家族への曝露は他のタイプの曝露よりも感染につながる可能性が高く、感染した人と世帯を共有する人々は隔離中に接触してはならず、家族で接触した人は隔離されるべきであることを示唆しています。 2つの地域のホットスポット（VestfirdirとVestmannaeyjar）の血清有病率は、隔離外が存在しないか低いため、qPCRスクリーニングによってほとんどの感染が検出され、隔離、社会的距離、連絡先の追跡、および集団集会の制限が拡散の制限に効果的であったことを示しています。
qPCR陽性者の90％以上が、pan-Ig SARS-CoV-2抗体アッセイの両方で陽性と診断され、診断から120日後に血清陽性のままであり、2つのpan-Igアッセイで検出された抗体レベルの低下はありませんでした。いくつかの単一Igアッセイでは、抗体価の低下が観察されました。以前の小規模な研究では、Nタンパク質およびSタンパク質を表すペプチドに対するIgG抗体の低下が21〜28日以内に報告されています。これらの不一致は、使用されるアッセイの特異性と感度の違い、および研究対象の抗原と分析の感度と範囲などの使用される半定量的アッセイの設計と性能の違い、および研究の対象の違いによって部分的に説明されます。たとえば、qPCRのテストとスクリーニングが広まっているため、他の研究の参加者と比較して、アイスランドのqPCR陽性者は健康であった可能性が高いです。感染の有病率が低いことを考えると、SARS-CoV-2への反復暴露がアイスランドの抗体レベルの持続に影響を与える可能性は低いです。検証済みの定量的SARS-CoV-2抗体アッセイを使用した比較研究が必要です。出版された文献に記載されているものは、小さなサンプルサイズに基づいています。
初期のサンプルで（pan-Ig抗体検査の組み合わせを使用して）陰性の結果が得られ、少なくとも1か月後に別のサンプルが検査された22人の回復した人のうち、19人（86％）が2回目の陰性の結果を受け取りました。したがって、SARS-CoV-2に感染した一部の人は、S1およびNタンパク質に反応する抗体を検出できないか、検出できないレベルの抗体を産生し、感染後3か月でも、または一部のqPCRは偽陽性の結果をもたらしました。
回復した人の中で、抗体レベルは高齢者とSARS-CoV-2感染により深刻な影響を受けた人で高くなっています。男性よりも病気になる傾向がある女性は、2つのスパイクタンパク質抗体アッセイで抗体レベルが低かったです。 SARS-CoV-2抗体レベルは喫煙者で低かったです。喫煙は若年成人の間の重度のCovid-19疾患の可能性を高め、喫煙はSARS-CoV-2ウイルスの細胞侵入の受容体であるACE2の発現を増加させることが報告されています。
体液性免疫応答は、細胞変性ウイルスの除去に重要であり、一般にウイルスの再感染の防止に重要です。SARS-CoV-2感染に対する体液性免疫応答とこのウイルスによる再感染に対する予防の関係は、アカゲザルで示されていますが、人間ではまだ確立されていません。 SARS-CoV-2に対する血清陽性と再感染に対する防御との関係や欠如に関係なく、アイスランドにおけるSARS-CoV-2抗体の血清陽性率が低いことは、アイスランドの人々が感染の第2の波に対して脆弱であることを示しています。
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