翻訳日：2020/05/23
原文【査読後で校正前の論文】Targets of T cell responses to SARS-CoV-2 coronavirus in humans with COVID-19 disease and unexposed individuals
COVID-19感染症および非被曝者のヒトにおけるSARS-CoV-2コロナウイルスに対するT細胞応答の標的
概要
SARS-CoV-2に対する適応免疫を理解することは、ワクチン開発、コロナウイルス感染症2019（COVID-19）の病因の解釈、およびパンデミック対策のキャリブレーション(較正)にとって重要です。 HLAクラスIおよびII予測ペプチド「メガプール」を使用して、流行するSARS-CoV-2特異的CD8+およびCD4+T細胞が、それぞれCOVID-19回復期患者の約70％と100％で同定されました。ほとんどのワクチンが認識する主なターゲットであるスパイクに対するCD4+T細胞の反応は強固で、抗SARS-CoV-2 IgGおよびIgA力価の大きさと相関していました。 M、スパイク、およびNタンパク質はそれぞれ、CD4+応答全体の11〜27％を占め、一般的にnsp3、nsp4、ORF3a、ORF8などをターゲットにした追加の応答があります。 CD8+T細胞では、スパイクとMが認識され、少なくとも8つのSARS-CoV-2 ORFがターゲットにされました。重要なのは、曝露していない個人の約40〜60％でSARS-CoV-2反応性CD4+T細胞が検出されたことから、流行する「風邪」コロナウイルスとSARS-CoV-2の間の交差反応性T細胞認識が示唆されました。
序文
COVID-19は世界的な緊急事態です。最初の症例は2019年12月に発生し、現在では5月1日現在、世界で240,000人の死亡と3,000,000人のSARS-CoV-2感染が報告されています（Dong et al., 2020; Wu and McGoogan, 2020）。SARS-CoV-2に対するワクチンは開発が始まったばかりです（Amanat and Krammer, 2020; Thanh Le et al., 2020）。パンデミックの急速な出現により、SARS-CoV2ヒトT細胞の反応の情報がありません。このウイルスに対するT細胞の反応に関する基礎的な情報が早急に必要です。
その理解のための最初の段階は、ウイルス特有のCD4+およびCD8+T細胞を定量化することです。その知識が早急に明らかになることで、免疫とSARS-CoV-2感染の病因に関する洞察を提供し、同じ知識がワクチンの設計および候補ワクチンの評価の参考となります。免疫の推定も将来のソーシャルディスタンスのパンデミック対策における疫学モデルの較正の中心です（Kissler et al., 2020）。そのような予測は、SARS-CoV-2感染が実質的な免疫を生み出すかどうか、及びSARS-CoV-2と流行する季節性の「普通の風邪」ヒトコロナウイルスとの間に交差反応性免疫が存在するかどうかによって、劇的に異なります。ヒト抗原特異的SARS-CoV2 T細胞応答の定義と評価は、広範なエピトーププールを使用した直接のex vivo T細胞アッセイと、任意のサイトカイン分極のT細胞を検出することができるアッセイで最適に行われます。ここでは、COVID-19患者からの血液サンプルによる評価によって行われました。
SARS-CoV-2に対する適応免疫応答が、防御的か病原性を持つのか、あるいは両方のシナリオがタイミング、構成、適応免疫応答の大きさによって起こるのかについては、不明瞭な点が多くあります。仮説の範囲は広く（Peeples、2020）、重症急性呼吸器症候群（SARS）またはMERS（Alshukairi et al., 2018; Wong et al., 2004; Zhao et al., 2017）またはSARSを用いたマウスの動物モデルデータ（Zhao et al., 2016; Zhao et al., 2010; Zhao et al., 2009）、NHPのSARS（Liu et al., 2019; Takano et al., 2008）または猫のFIPV（Vennema et al., 1990）から入手可能な臨床データを基づいています。防御免疫、免疫病原性、およびCOVID-19に対するワクチン開発について、SARS-CoV-2に対するT細胞応答の定義の重要性を導くことに関して、以下で簡単に説明します。
2003-2004年のSARS患者のデータに基づく（SARS-CoVが原因で、SARS-CoV-2ヒトベータコロナウイルスに最も密接に関係する）、およびほとんどの急性ウイルス感染症は防御免疫の発現をもたらす（Sallusto et al., 2010）という事実に基づき、実質的なCD4+T細胞、CD8+T細胞を持っている可能性、および中和抗体応答がSARS-CoV-2で発現し、すべてが急性感染症の排除に寄与し、そして、当然の結果として、いくつかのT細胞とB細胞は、SARS-CoV-2感染に対して免疫学的記憶および防御免疫として長期間（すなわち複数年）保持されます（Guo et al., 2020b; Li et al., 2008）。ただし、反対の視点も正しいです。ほとんどの急性感染症は防御免疫の発現をもたらしますが、利用可能なヒトコロナウイルスのデータは、実質的な適応免疫応答の獲得に失敗する可能性があり（Choe et al., 2017; Okba et al., 2019; Zhao et al., 2017）、堅牢な防御免疫の発現に失敗することがあることを示唆しています（Callow et al., 1990）。防御免疫の発現に失敗するのは、T細胞および/または抗体が不十分な規模や期間の応答だったために起こることがあり、中和抗体応答はCD4+T細胞応答に依存します（Crotty, 2019; Zhao et al., 2016）。したがって、SARS- CoV-2に対するヒトCD4+およびCD8+T細胞応答の大きさと構成を早急に理解する必要性があります。仮にSARS-CoV-2による自然感染が、防御的な抗ウイルス免疫と関連した効果的なCD4+およびCD8+T細胞応答を誘発する場合、COVID-19は緊急なワクチン開発の有力な候補となります。
COVID-19の免疫病原性は深刻な問題です（Cao, 2020; Peeples, 2020）。SARS-CoV-2に対する初期のCD4+およびCD8+T細胞応答は防御的である可能性が高いですが、ヒトにおけるSARS- CoV-2の効率的な自然免疫回避メカニズムのため（Blanco-Melo et al., 2020）、初期の応答を起こすのは難しいです。SARS-CoV-2による免疫回避は、高齢者における骨髄細胞抗原提示細胞（APC）機能または可用性の低下（Zhao et al., 2011）によって、悪化すると考えられます。そのような場合、後期T細胞応答が、多様な想定されるメカニズムによって、肺に高ウイルス量が持続的に存在する場合に病原的な炎症状態を代わりに増幅する可能性があると考えられます（Guo et al., 2020a; Li et al., 2008; Liu et al., 2019）。危機的な（ICU）および致命的なCOVID-19（およびSARS）の結果は、IL-6を含む炎症性サイトカインとケモカインのレベルの上昇に関連しています（Giamarellos-Bourboulis et al., 2020; Wong et al., 2004; Zhou et al., 2020）。
急性ウイルス感染症に対するワクチン開発は、自然感染によって誘発される防御的免疫応答のタイプのワクチンを誘発する反復発生に古典的に焦点を当てています。そのような基礎的な知識は、現在、COVID-19で不足していて、不足する情報には、どのようなバランスであるかや、疾患の経過と重症度の作用が異なる応答細胞の型が含まれます。そのような知識は、SARS-CoV-2に対する防御免疫を引き出す可能性が最も高いワクチン戦略の選択を導くことができます。さらに、COVID-19に対するT細胞の応答に関する知識は、COVID-19候補ワクチンの臨床試験の適切な免疫学的エンドポイントの選択を導くことができます。
ヒトT細胞免疫応答によって、どのSARS-CoV-2タンパク質が認識されるかについての限られた情報も利用可能です。一部の感染症では、T細胞応答は特定のウイルスタンパク質に強く偏っていて、標的はCD4+およびCD8+T細胞の間で実質的に変化できます（Moutaftsi et al., 2010; Tian et al., 2019）。SARS-CoV-2タンパク質およびヒトT細胞応答が認識するエピトープに関する知識は即座に明らかになり、世界中の研究所でCOVID-19免疫応答のモニタリングを可能にします。エピトープに関する知識は、候補となるワクチン設計の補助とワクチン候補の免疫原性の評価を容易にします。現在のCOVID-19ワクチンのほぼすべてがスパイクタンパク質に焦点を当てています。
SARS-CoV-2免疫の研究で考慮すべき最後の重要な問題は、ある程度の交差反応性コロナウイルス免疫は、人間の人口の一部に存在するかどうか、そしてこれがCOVID-19感染症への感受性に影響を与える可能性があるかどうかです。この問題は、交差反応免疫は候補ワクチンへの応答性に影響を与える可能性があるため、ワクチンの開発にも関連しています（Andrews et al., 2015）。
要するに、SARS-CoV-2感染に反応するヒトCD4+およびCD8+T細胞の反応を測定および理解する能力は、現在COVID-19ワクチンの開発を妨げている主要な知識の差、COVID-19感染症の病因の解釈、および将来のソーシャルディスタンスのパンデミック対策の較正です。
結果
SARS-CoV-2ペプチドと予測クラスIおよびクラスIIエピトープ
我々は最近、免疫エピトープデータベースと分析リソース（IEDB）を利用して、SARS-CoV-2 T細胞エピトープを予測しました（Dhanda et al., 2019; Vita et al., 2019）。バイオインフォマティクスアプローチを利用して、我々はT細胞標的である可能性が高いSARS-CoV-2の特定のペプチドを同定しました（Grifoniet al., 2020）。以前に私たちはメガプール（MP）アプローチを開発して、多数のエピトープを同時に検査できる。この手法により、多数のエピトープが可溶化され、蓄えられ、細胞毒性の問題を回避するために凍結乾燥されました（Carrasco Pro et al., 2015）。これらのMPは、アレルギー（Hinz et al., 2016）、結核（Lindestam Arlehamn et al., 2016）、破傷風、百日咳（Bancroft et al., 2016; da Silva Antunes et al., 2017）およびデング熱ウイルス、CD4+およびCD8+T細胞エピトープの両方（Grifoni et al., 2017; Weiskopf et al., 2015）を含む多くの適応症のヒトT細胞研究に用いられます。ここでは、予測されたSARS-CoV-2エピトープに基づいてMPを生成しました。具体的には、1 つのMPは、221の予測されたHLAクラスII CD4+T細胞エピトープ（Grifoni et al., 2020）に対応し、スパイク（S）抗原（CD4_R MP）は別として、ウイルスゲノム内の全てのタンパク質をカバーします。予測戦略に利用されているのは、全応答の約50％を獲得することであり（Dhanda et al., 2018; Paul et al., 2015）、民族性およびHLA遺伝子多型とは無関係に優性エピトープを予測するために設計および検証されました。このアプローチは、無差別なエピトープを予測するために異なるHLAクラスII遺伝子座と対立遺伝子変異の間で、広範な交差反応性と重複の範囲を利用して、最も一般的なHLAクラスIIプロトタイプの特異性の多くを結合できます（Greenbaum et al., 2011; O’Sullivan et al., 1991; Sidney et al., 2010a, b; Southwood et al., 1998）。
スパイクタンパク質の場合、この重要な抗原に対するすべてのT細胞反応性は確実に検出され、我々は10残基（MP_S、Table S1）が重複した253の15merペプチドで抗原全体をカバーする別のMPを生成しました。上記のように、MPは総応答の約50％を占めると期待される非スパイク領域をプローブするために使用されます。重複するペプチドの使用は、より完全な特性評価が可能になる代わりにORF全体を使用しますが、より多くの細胞が必要になります。この因子は、それらのプールにとって、CD4+T細胞応答の大きさの比較の観点から覚えておく必要があります。
CD8エピトープの場合、異なるHLAクラスI対立遺伝子変異体と遺伝子座の間の重なりは、特定の対立遺伝子群またはスーパータイプに限定され（Sidney et al., 2008）、12の最も著名なHLAクラスIAおよびB対立遺伝子のセットをターゲットとして、一般人口の広い範囲（> 85％）を可能にします。2つのクラスI MPは、それらの12の最も一般的なHLA AおよびB対立遺伝子のエピトープ予測に基づいて合成され(Grifoni et al., 2020)、これらはSARS-CoV-2プロテオーム全体（CD8 MP-AおよびMP-B）の628の予測HLAクラスI CD8+T細胞エピトープを網羅します。
回復したCOVID-19患者の免疫学的表現型
感染後のSARS-CoV-2 CD4+およびCD8+T細胞応答の生成をテストするために、COVID-19感染症から回復した20人の成人患者を最初に募集した（表1）。また、2015-2018年に収集された地元の健康な対照ドナーからのPBMCと血漿サンプルを利用しました（参照 STARメソッド）。血液サンプルは、すでに症候はない入院中のCOVID-19患者から症状発現後20-35日で採取されました。SARS-CoV-2感染は、感染の急性期にスワブテストウイルスPCRによって確定されました。SARS-CoV-2曝露の検証は、側方流動血清学およびSARS-CoV-2スパイクタンパク質受容体結部位合（RBD）ELISAの両方で試みられ（Stadlbauer et al., 2020）、回復期の血液からの血漿を使用しました。ほとんどの患者は側方流動Ig検査で陽性と確認されました（表1）。すべての患者は、SARS-CoV-2 RBD ELISAによりCOVID-19症例と確認されました（図1、S1）。すべての症例はIgG陽性でした。抗RBD IgMとIgAも大多数の症例で検出されました（図1、S1）。
回復したCOVID-19の免疫学的細胞プロファイルを広く評価するために（図1、S2）、単核白血球の系統と表現型の21色フローサイトメトリーパネルを定義しました（表S2）。回復したCOVID-19患者は、暴露していない対照と比較して、CD3+細胞の頻度はわずかに増加しましたが、2つのグループ間のCD4+またはCD8+T細胞の頻度は、全体的に有意差は観察されませんでした。CD19 +細胞の頻度は少し減少しましたが、CD3–CD19–細胞またはCD14 + CD16 –単球の頻度には違いは観察されませんでした（図1、S2）。回復した患者では、論文と一致する一般的なリンパ球減少症は観察されませんでした。次に、SARS-CoV-2 MPを利用して、CD4 +およびCD8 + T細胞応答を調べました。
SARS-CoV-2 -特異的CD4+T細胞応答の同定と定量化
T細胞受容体−（TCR）依存型活性化誘導マーカー（AIM）アッセイを利用して、回復したCOVID-19人の患者におけるSARS-CoV-2 -特異的CD4 + T細胞の同定と定量化をしました。ヒト抗原特異的SARS-CoV-2 T細胞応答の初期定義と評価は、MPなどの広範なエピトーププールを使用した直接ex vivo T細胞アッセイ、および未知のサイトカイン分極と機能的属性のT細胞を検出できるアッセイで行うのが最適です。AIMアッセイは、抗原特異的CD4+T細胞を同定するためのサイトカインに依存しないアッセイです（Havenar-Daughton et al., 2016; Reiss et al., 2017）。AIMアッセイは、ウイルス特異的、ワクチン特異的、または結核特異的な一連の研究における特定のCD4+T細胞を同定するためにうまく使用されています（Dan et al., 2019; Dan et al., 2016; Herati et al., 2017; Morou et al., 2019）。
我々は10人のCOVID-19症例と11人の健康なコントロール（SARS-CoV-2未曝露、2015-2018年に収集）のスパイクMP（MP_S）とSARS-CoV-2全タンパク質コーディング領域の残り（「非スパイク」、MP CD4_R）をカバーするクラスII MPのPBMCsを刺激しました。CMV MPがポジティブコントロールとして使用され、ネガティブコントロールとしてDMSOを使用しました（図2、S3）。SARS-CoV-2スパイク固有のCD4 + T細胞応答（OX40 + CD137 +）は、COVID-19症例の100％で検出されました（p <0.0001 vs. 未曝露ドナーのスパイクMP、図2A-B。p = 0.002 vs. DMSOコントロール、図2C）。SARS-CoV-2全タンパク質コーディング領域の残りのCD4 + T細胞応答もCOVID-19症例の100％で検出されました（p <0.0079 vs. 未曝露ドナーの非スパイクMP、図2A-B。p = 0.002、非スパイク vs. DMSOコントロール、図2C）。SARS-CoV-2-特異的CD4+T細胞応答の大きさは、CMV MPと類似して測定しました（図S3C）。独立した実験のSARS-CoV-2-特異的CD4+T細胞の測定の一致率は高かったです（p <0.0002、図S3D）。SARS-CoV-2 -特異的CD4 + T細胞応答の機能と分極化を評価するために、我々は、MP刺激に応答して分泌されるサイトカインを測定しました。SARS-CoV-2 -特異的CD4 +細胞は機能的で、その細胞は非スパイクおよびスパイクMPへの応答してIL-2を産生しました（図2D）。細胞の分極は古典的なT H 1型のように現れ、実質的なIFNγが産生されましたが（図2E）、IL-4、IL-5、IL-13、またはIL-17αの出現はほとんどありませんでした（図S3G-J）。
したがって、回復したCOVID-19患者は、SARS-CoV-2に対して一貫して実質的なCD4+T細胞応答を産生しました。指標として刺激指数を使用して同様の結論に達しました（図S3E-F）。ドナーあたりのCD4+T細胞応答（図2A）の総数の観点から、検出された反応の平均50%がスパイクタンパク質に直結していて、約50％はSARS-CoV-2全タンパク質コーディング領域の残りのMPを表す部分に直結していました（図2A）。これは重要で、SARS-CoV-2スパイクタンパク質は、開発中のCOVID-19ワクチン候補の圧倒的多数の主要コンポーネントです。注目すべきは、MP_Rペプチド予測の性質を考えると、非スパイクORFに起因する実際のCD4+T細胞応答はより高い可能性があり、次のさらなる実験で対処されました。
SARS-CoV-2-特異的CD8+T細胞応答の同定および定量化
回復したCOVID-19患者のSARS-CoV-2-特異的CD8+ T細胞を測定するために、我々はAIMアッセイおよび細胞内サイトカイン染色（ICS）という2つの補完的な方法論を利用しました。CD8-AおよびCD8-B の2つのSARS-CoV-2クラスI MPを用いて、CMV MPおよびDMSOをそれぞれポジティブおよびそれぞれネガティブコントロールとして用いました（図3、S4）。CD8+T細胞応答は、COVID-19症例の70％でAIM（CD69+CD137+）によって検出されました（p <0.0011 vs.未曝露ドナー「CD8合計」、図3A-B。p = 0.002、CD8-AまたはCD8-B vs. DMSOコントロール、図S4B）。MP CD8-Aには、他のたんぱく質のエピトープの中で、スパイクエピトープが含まれています。AIMで測定したSARS-CoV-2反応性CD8+T細胞応答の大きさは、CMV MPよりもやや低かったです（図S 4C）。同様の結論は、刺激指数を使用して達成しました（図S3D-E）。
独立して、ICSアッセイは、COVID-19症例の大部分で、IFNγ+SARS-CoVの-2 -特異的CD8 +の大部分においてT細胞を検出しました（図3C-D）。IFNγ+細胞の大半は、グランザイムBも発現しました（図3D-E ）。IFNγ+細胞のかなりの部分で、TNFを発現し、IL-10は発現しませんでした（図3D）。したがって、回復したCOVID-19患者の大多数は、SARS-CoV-2に対してCD8+T細胞応答を産生しました。
SARS-CoV-2-特異的CD4+T細胞応答とIgGおよびIgA力価の関係
ほとんどの防御抗体反応は、CD4+T細胞の反応に依存しています。したがって、我々はより強いSARS-CoV-2-特異的CD4 + T細胞応答が、より高い抗体力価と関連していたかどうかを評価しました。そのスパイクがSARS中和抗体の主要なターゲットであることを考えると、我々はスパイク特異的CD4+T細胞を調べました。スパイク特異的CD4+T細胞応答は、抗スパイクRBD IgG力価の大きさとよく相関していました（R =0.81。p<0.0001。図4A。同様の結果が刺激指数を使用して得られました、図S5A）。非スパイクSARS-CoV-2 -特異的CD4+T細胞応答は、抗スパイクRBD IgG力価と相関せず（図4B、S5B）、分子内CD4+ T細胞反応の一般的な必要性と一致しています（Sette et al., 2008）。抗スパイクIgA力価もスパイク特異的CD4+T細胞と相関しています（p <0.0002、図S5）。したがって、COVID-19患者は抗スパイクRBD抗体応答をスパイク特有CD4+T細胞応答の大きさに応じて作成します。我々は次にSARS-CoV-2に対するCD4+ とCD8+T細胞応答の関係を評価しました。SARS-CoV-2 -特異的CD4+およびCD8+T細胞応答はよく相関していました（R = 0.62、P = 0.0025、図4C及びS5）。したがって、SARS-CoV-2 に応答する抗体、CD4 +およびCD8+T細胞応答は一般によく相関していました。
既存の交差反応性コロナウイルス特異的T細胞
スパイク-および非スパイク-特異的CD4+T細胞応答は、すべてのCOVID-19症例で検出可能でしたが、細胞はまた、曝露されていない個体においても検出されました（図3A-B）。これらの反応は非スパイク特異的CD4+T細胞反応性に統計的に有意でした（非スパイク、p = 0.039。スパイク、p = 0.067。図5A-B）。非スパイク−特定CD4+T細胞応答は、SIをベースとしたドナー（提供者）の50％で検出限界を超えていました（図S3E）。すべてのドナーは、2015年から2018年の間に募集され、SARS-CoV-2への曝露の可能性は排除されました。4つのヒトコロナウイルスが季節性の「一般的な風邪」上気道感染症の原因として知られています：HCoV-OC43、HCoV-HKU1、HCoV-NL63、およびHCoV-229E。我々はSARS-CoV-2未曝露ドナーを、代表的なベータコロナウイルスとアルファコロナウイルスとして、HCoV-OC43およびHCoV-NL63に対する血清反応性で検査しました。すべてのドナーはHCoV-OC43およびHCoV-NL63 RBD に対してIgG陽性で（図5C）、これらのウイルスの固有の性質と一致しました（Gorse et al., 2010; Huang et al., 2020; Severance et al., 2008）。したがって、我々はこれらが、SARS-CoV-2エピトープを認識できる真の汎コロナウイルスT細胞を表すかどうかを検討しました。
CD4+およびCD8+T細胞のSARS-CoV-2 ORFターゲット
SARS-CoV-2免疫応答を理解する一連の問題の中で、最も切迫していて、今だ未解決なのは、CD4+およびCD8+T細胞が標的とする抗原は何か、対応する抗原が同じか異なるのか、そしてCOVID-19ワクチン開発で現在検討されている抗原をどのように反映するかです。SARS -CoV-2の全シーケンスにまたがる重複ペプチドのセットを合成し、およびそれらを個別にプールして、各プールが1つの抗原を表すようにします（例外は2つのプールが作成されたnsp3。表S1）。 CD4+T細胞応答の場合、SARS-CoV-2ゲノム構成に基づく抗原特異性の明らかなパターンは観察されませんでした。しかし、コロナウイルスは、サブゲノムRNAsを介して感染細胞の特定のORFのタンパク合成を増加します。サブゲノムRNAsの相対的存在量によって（図6A）（Irigoyen et al., 2016; Snijder et al., 2003; Xie et al., 2020）、ORFsは予測されるタンパク質存在量に基づいて並べ替えられました（図6B）。SARS-CoV-2-特定的CD4+T細胞のターゲットの明確な階層は、SARS-CoV-2 ORFスパイク、M、およびNが高度に発現して認識されるCOVID-19症例におけるCD4+T細胞応答の大部分とともに明らかになります。平均して、これらの抗原は、総CD4+T細胞応答のそれぞれ27％、21％、11％を占めていました。ほとんどのCOVID-19症例は、SARS-CoV-2 nsp3、nsp4、ORF8に特異的なCD4+T細胞もありました（図6B）。総CD4+T細胞応答の約5％を平均で占めました（図6C）。E、ORF6、仮想ORF10、およびnsp1はすべて小さな抗原であり（ORF10の場合、潜在的に発現されない）、ほとんどの場合、結果として認識されません。これらの結果はやや予想外です、なぜならIEDBでキュレーションされた27の異なる研究から、他のコロナウイルスのデータは、報告されているCD4+T細胞の反応性のほぼ3分の2をスパイクが占めています（表S3）。公開された文献で存在するエピトープのほとんどはNですが、ただしヒトN特異的CD4+T細胞応答は、ヒトSARS-CoV-1 T細胞応答の最も包括的な研究の1つでは観察されませんでした（Li et al., 2008）。コロナウイルスMは、以前はCD4 + T細胞応答の有力な標的として記載されていませんでした（表S3）。まとめると、これらの結果は、SARS2全タンパク質コーディング領域を完全にスキャンしたものは、感染細胞におけるウイルスタンパク質量の予測値と大部分で相関する回復期COVID-19症例における堅牢かつ多様なSARS-CoV-2-特異的CD4+T細胞反応性のパターンを示しています。
非曝露ドナーを調べると、CD4+T細胞標的のパターンが変化しました。Sはまだ比較的有力な標的でしたが（平均で全体の23％）、SARS-CoV-2 NおよびMに対して反応性がないか、限界的でした。検出可能なCD4+T細胞を有するドナーの間で、反応性の変化はSARS-CoV-2 nsp14（25％）、nsp4（15％）およびnsp6（14％）に対して観察されました（図6B-C）。SARS-CoV-2-反応性CD4+T細胞が少なくとも6人の異なる非曝露ドナーで検出され、交差反応性は比較的広く分布していることを示しています（図S6A）。
複数のドナーでCD4+T細胞反応性についてSARS-CoV-2全タンパク質コーディング領域全体をスキャンした後、エピトープ予測MPアプローチが、ヒトCD4+T細胞が標的とするSARS -CoV-2エピトープの濃縮に成功したかどうかを評価することができました。CD4_R MPで観察された総反応性は、すべての抗原プールの合計に対してプロットされ（スパイクを除く、スパイク予測はCD4_R MPには含まれていません）、有意な相関が観察されました（p <0.0002、図S6C）。単一のMP-Rは、COVID-19ドナーあたりの非スパイク応答の約50％を捕捉し（44％+/-範囲28-80％）、上記に示したように全応答の約50％を捕捉するために考案された予測アプローチの成功を示します（Dhanda et al., 2018; Paul et al., 2015）。
CD8+T細胞応答の場合、他のコロナウイルスの論文データで（IEDBで収集された57のさまざまな研究、表S3）は、50％のスパイクアカウンティングと、定義されたエピトープの36％のNアカウンティングを報告しました。ヒトSARS-CoV-1応答の大規模な研究で、スパイクがCD8+T細胞応答が本質的に唯一の標的として報告されました（Li et al., 2008）、一方MERS CD8+の研究で、応答はスパイク、NおよびM/Eペプチドのプールで認められました（Zhao et al., 2017）。少数のエピトープが、他のコロナウイルス抗原から報告されています（表S3）。ここでは、SARS-CoV-2全タンパク質コーディング領域をCD8+T細胞を認識するためにスキャンしました。我々のデータは、SARS-CoV-2 CD8+T細胞反応性の免疫優性とやや異なるパターンを示していて（図6D-E）、スパイクタンパク質は反応性の〜26％であり、Nは〜12％を占めます。COVID-19から回復した対象の顕著な反応性は、M（22％）、nsp6（15％）、ORF8（10％）、ORF3a（7％）などの他の抗原に由来していました（図6D-E）。曝露されていないドナーで、SARS-CoV-2 -反応性CD8+T細胞は、少なくとも4つの異なるドナーで検出され（図S7）、特定のSARS-CoV-2タンパク質は、CD4+T細胞で観察されたよりもターゲティングが明確ではなく、コロナウイルスCD8+T細胞の交差反応性は存在しますが、CD4+T細胞の交差反応性よりも広くは見られません。
議論
SARS-CoV-2に対するT細胞応答に関する基礎知識が非常に求められています。ここで我々は、回復したCOVID-19症例に由来するPBMCを用いて、エピトープ「メガプール」に配置されたときに予測されるエピトープの機能検証を報告します。実験は、どのSARS-CoV-2タンパク質が、COVID-19感染症で産生するヒトSARS CoV-2-特異的CD4+およびCD8+T細胞の主要な標的であるかを決定するためにタンパク質特異的ペプチドプールを用いました。重要なのは、健康な対照ドナーからの血液サンプルを用いたまったく同じ一連の実験技術を用いて（2015-2018の時間枠で収集されたPBMC）、および実質的な交差反応性コロナウイルスT細胞の記憶が観察されました。
私たちの結果は、エピトープMPが、限られたサンプル材料でのSARS-CoV-2–特異的T細胞応答の分析と検出に最適な試薬であることを示しています。我々はSARS-CoV-2ゲノムでエンコードされた25のタンパク質のそれぞれに対応するペプチドプールも開発し検査しました。エピトープMPとタンパク質ペプチドプール実験の両方から、ヒト、HLAトランスジェニックマウス、野生型マウスや他の種で研究されている他のコロナウイルス、特にSARSおよびMERSウイルスで観察された、以前に報告されたT細胞応答免疫優勢パターンの内容を解読できます。CD4+T細胞応答の場合、他のコロナウイルスのデータで、スパイクは、報告されたCD4+T細胞反応性のほぼ3分の2を占め、NとMは限定的な反応性で、ヒトSARS-CoV-1応答の1つの大規模な研究では反応性がないことが報告されました（Li et al., 2008）。我々のSARS-CoV-2データは、COVID-19の免疫優勢のパターンが異なることを明らかにしました。特に、M、スパイク、Nタンパク質は明らかに共優性であり、それぞれがここで調査されたCOVID-19症例の100％で認められました。有意なCD4 + T細胞応答は、nsp3、nsp4、ORF3s、ORF7a、nsp12、ORF8でも見られました。これらのデータは、唯一のSARS-CoVのスパイクからなるCOVID-19ワクチンの候補が、自然のCOVID-19感染症と同様に現れるSARS-CoV-2-特異的CD4+T細胞応答を誘発することができることを示唆していますが、そのデータはSARS-CoV-2 には多くの潜在的なCD4+T細胞標的があり、軽度から中程度のCOVID-19感染症で観察される天然のSARS-CoV-2-特異的CD4+T細胞応答をより模倣するMとNのような追加的なSARS-CoV-2構造抗原が含まれています。
SARS-CoV-2 CD8+T細胞応答に関して、ここで見られる免疫優性のパターンは、他のコロナウイルスの文献とは異なりました。ただし、厳密な比較はできません。以前のいくつかの研究は、同様に包括的ではなく、同じ実験的な戦略を利用していませんでした。スパイクタンパク質は、ヒトSARS-CoV-2 CD8+T細胞応答の標的でしたが、支配的ではありません。SARS-CoV-2 Mも同様に強く認識され、また有意な反応性は、他の抗原、主に、CD8+T細胞応答全体のほぼ50％を平均して占めるnsp6、ORF3a、およびNでも認められました。したがって、これらのデータは、COVID-19ワクチンの候補が、スパイクタンパク質に対するCD8+T細胞応答を誘発し、軽度から中程度のCOVID-19感染症で観察された自然のCD8+T細胞応答と比較して、比較的狭いCD8+T細胞応答を誘発すると可能性があります。SARS-CoV-2に対する最適なワクチンCD8+T細胞応答は、M、nsp6、ORF3a、および/またはNに由来する追加的なクラスIエピトープの恩恵を受ける可能性があります。
COVID-19ワクチンアプローチ特定の候補による疾患のワクチン強化に関して、抗体依存性増強（ADE）またはTH2応答の進展の懸念があった（Peeples, 2020）。ここでは、回復期のCOVID-19症例において、優位なTH1応答が見られ、TH2サイトカインはわずか又は全くありませんでした。明らかにより多くの研究が必要ですが、ここのデータは主に、SARS-CoV-2に対する古典的なTH1応答を優位に示しています。
COVID-19症例で抗原特異的T細胞応答を特定することは重要でしたが、コロナウイルスとの間に交差反応免疫が存在するかどうかを理解することは非常に興味深いです。その理解を深めるための重要なステップは、COVID-19症例と曝露されていない健康な対照の抗原特異的CD4+およびCD8+T細胞を調べることと、完全に同じ抗原と実験技術の方法を用いることです。CD4 +T細胞応答は、未曝露の人の40-60％で検出されました。これは、SARS-CoV-2に対する全てではないが一部の個人におけるある程度の交差反応、既存の免疫を反映している可能性があります。この免疫が臨床結果への影響に関連しているかどうかは不明であり－個人のSARS-CoV-2感染前後のT細胞測定なしでは知ることができない－、しかし、交差反応性CD4+T細胞が、SARSマウスモデルに基づいた防御免疫の価値があるかもしれません（Zhao et al., 2016）。交差反応性ペプチド、および他のコロナウイルスに対する配列相同性関係の明確な同定は、現在利用可能な細胞数、および現状の研究の時間枠では実行できないポジティブペプチドプールの解析が必要です。
交差反応性T細胞の値に関して、パンデミックと関係したインフルエンザ（インフルエンザ）免疫学との関係は有益かもしれません。2009年のH1N1インフルエンザのパンデミックに関連して、既存のT細胞免疫は成人集団に存在し、それはより保存された内部的なインフルエンザウイルスに焦点を当てました（Greenbaum et al., 2009）。交差反応性T細胞の存在は、低い重症感染症との関連が知られています（Sridhar et al., 2013; Wilkinson et al., 2012）。交差反応型メモリーT細胞応答の可用性は、H1N1インフルエンザパンデミックの重症度の低さに貢献した１つの因子かもしれません（Hancock et al., 2009）。インフルエンザ株に対する交差反応性は、新たに出現した、パンデミックの可能性のあるインフルエンザ株に対する感受性の重要な影響因子となるようにモデル化されました（Gostic et al., 2016）。進行中のCOVID-19パンデミックの深刻さを考えると、人口における交差防御的なコロナウイルス免疫の程度が、パンデミックの全体的な道のり、および今後数年間の疫学のダイナミクスに対して、非常に高い影響があることを示しています（Kissler et a., 2020）。
制限と将来の方向性
この研究の注意事項には、サンプルサイズと病院に入院していないCOVID-19症例に焦点をあてています。サンプルサイズは便宜のために制限されました。COVID-19の未入院の症例は期間に焦点をあてて、これらのドナーは中程度の期間の合併症のない疾患であり、したがってそれは、すべての症例で実質的なCD4+T細胞および抗体応答が検出され、そしてほとんどの場合のCD8+T細胞反応でした。急性の患者や複雑な疾患の経過のある患者からのMP T細胞データとともにこれらのデータを補完すると、明確な価値があり、SARS-CoV-2免疫学的記憶の寿命について学べます。さらに、SARS-CoV-2への曝露前の低温の病歴または一致する血液サンプルに対する共通の詳細情報の欠如は、SARS-CoV-2への曝露前の交差反応性コロナウイルスT細胞の存在量とそのような細胞の潜在的な防御効果によって、結果を予防できます。最終的に将来の完全なエピトープマッピングは、ヒトコロナウイルス特異的T細胞応答の重要な詳細な解決策を加えるでしょう。
まとめると、我々は、COVID-19の症例におけるSARS-CoV-2-特異的CD4+およびCD8+T細胞応答を測定しました。複数の実験的アプローチを用いて、SARS-CoV-2 -特異的CD4+T細胞と抗体反応は、すべてのCOVID-19の症例で観察され、CD8+T細胞応答はほとんどで観察されました。重要なことは、SARS-CoV-2-交差反応性T細胞応答の事前の存在は、健康なドナーで観察され、人間の人口において、既存の免疫のいくつかの可能性を示します。T細胞特異的なORFマッピングは、候補ワクチン開発への組み入れの価値ある標的が明らかになり、COVID-19症例と暴露されていない健康な対照との間の明確な特異性パターンを明らかにしました。
図1. 回復したCOVID-19患者のSARS-CoV-2 IgM、IgA、およびIgG応答。
（A-C）SARS-CoV-2スパイクRBDに対する血漿ELISA力価。（A）IgG。（B）IgM。（C）IgA。「Neg」=2015-2018からの未曝露ドナー（n = 20）。「COVID」= COVID-19患者の回復期（n = 20）。すべてのデータは標準に基づくELISA力価として示されている。点線は検出限界を示す。幾何平均力価は幾何学的SDを示している。
（D-H）単核白血球の免疫表現型検査。次の頻度（D）CD3+T細胞総数、（E）CD4+T 細胞（CD4+CD3+）、（F）CD8+T細胞（CD8+CD3+）、（G）CD19+B細胞（CD19+CD3–）、（H）CD3-CD19-細胞、及び（I）CD14+CD16–単球（CD3–CD19–CD56–）未曝露ドナーのPBMCから（「Neg」、n = 13）またはCOVID-19患者の回復期（「COVID」、n = 14）。データはマンホイットニーを使用して分析され、平均値と標準偏差を表示。
* p <0.05、**** p <0.0001。図S1およびS2も参照。
図2. COVID-19から回復した患者のSARS-CoV-2 -特異的CD4+ T細胞応答。
（A）スパイクのみ（「スパイク」）MPまたはスパイクなし（「非スパイク」）のすべてのプロテオームを表すCD4_R MPを含むペプチドプールでPBMCを刺激した後、AIM+（OX40+CD137+）CD4+T細胞の割合でSARS-CoV-2 -特異的CD4+T細胞が測定された。データは、DMSO陰性対照に対して背景を差し引いたデータを幾何平均と幾何標準偏差で示している。サンプルは、非曝露ドナー（「非曝露」、n = 11）と回復したCOVID-19患者（「COVID-19」、n = 10）であった。
（B）FACSプロットの例、合計CD4+T細胞でゲート。
（C）陰性対照（DMSO）と抗原特異的刺激の間のCOVID-19症例におけるAIM+CD4+T細胞反応性。
（D-E）ペプチドプール刺激後のCOVID-19ドナーからのPBMCの上清でのサイトカインレベル（スパイクおよび非スパイク）またはネガティブコントロール（DMSO）。（D）IL-2。（E）IFNγ。
コホート間の統計的比較は、マンホイットニー検定を使用して行われた。ペアワイズ比較（C-E）はWilcoxon検定で実行された。
** p <0.01; *** p <0.001。図S3も参照。
図3. 回復したCOVID-19患者によるSARS-CoV-2-特異的CD8+T細胞応答。
（A）SARS-CoV-2 -特異的CD8+T細胞AIM+の割合として測定（CD69+CD137+）クラスI MPによるPBMCの刺激後のCD8 + T細胞（CD8-A、CD8-B、および結合データ（「合計」））。データはDMSO陰性対照に対して背景を差し引いたものであり、幾何平均と幾何標準偏差で表示。サンプルは、未曝露ドナー（「未曝露」、n = 11）と回復したCOVID-19患者（「COVID-19」、n = 10）である。
（B）FACSプロットの例。
（C）背景を差し引いた後のCOVID-19と未曝露ドナーからのPBMC におけるSARS-CoV-2のMP、又はCMV MP、に応答してIFNγを産生するCD8 +T細胞の割合。データは幾何平均と幾何標準偏差で表示。
（D）SARS-CoV-2 MPへの応答するグランザイムB（GzB）、TNFα（TNF）、またはIL-10のIFNγ+CD8+T細胞の機能的なプロファイル。平均値とSDを表示。
（E）IFNγおよびグランザイムB共発現のFACSプロットの例。
コホート間の統計的比較は、マンホイットニー検定を使用して行われた。
* p <0.05; ** p <0.01。; nsは有意差なし。図S4も参照。
図4. SARS-CoV-2-特異的CD4+T細胞、抗体、およびCD8+T細胞の相関。
（A）SARS-CoV-2スパイク-特異的CD4+T細胞（％）と抗スパイクRBD IgGとの相関関係。
（B）SARS-CoV-2非スパイク-特異的CD4+T細胞（％）と抗スパイクRBD IgGとの相関関係。
（C）SARS-CoV-2-特異的CD4 + T細胞とSARS-CoV-2 -特異的CD8+T細胞との相関関係。
ドナーごとの合計MP応答が各症例で使用された（「非スパイク」+ CD4+T細胞、CD8+T細胞のCD8_A + CD8_Bの「スパイク」（CD4_R + MP_S））。
統計的比較はSperman相関を使用して実行された。図S5も参照。
図5. 曝露されていない個人におけるSARS-CoV-2エピトープの反応性。
（A）SARS-CoV-2 -反応性CD4+T細胞はAIM+の割合として測定OX40+CD137+）未曝露（n = 11）のドナーのCD4+T細胞
（B）FACSプロットの例、合計CD4+T細胞でゲート。
（C）HCoV-OC43またはHCoV-NL63のRBDに対する血清反応性の血漿IgG ELISA。
ペアワイズ統計比較（A）は、Wilcoxon検定で実行された。* p <0.05; nsは有意差なし。
図6. COVID-19 症例と非曝露提供者におけるSARS-CoV-2特異的CD4+およびCD8+T細胞のタンパク質免疫優性
（A）SARS-CoV-2ゲノム構成および感染細胞におけるウイルスタンパク質量の予測。
（B）刺激指数によって定量化されたSARS-CoV-2抗原特異的CD4+T細胞（AIM+、OX40+CD137+）、各ウイルスタンパク質にペプチドプールを使用した（2つの例外を除き、表S1参照）。COVID-19症例（上、青色。n = 10）および未曝露ドナー（下、白。n= 10）。
（C）COVID-19症例（上）と非曝露ドナー（下）におけるCD4+T細胞によって認識されるSARS-CoV-2タンパク質の割合。
（D）刺激指数で定量化されたSARS-CoV-2抗原特異的CD4+T細胞（AIM+、OX40+CD137+）、各ウイルスタンパク質にペプチドプールを使用した（2つの例外を除き、表S1参照）。COVID-19症例（上、赤。n = 10）および未曝露ドナー（下、灰色。n= 10）。
（E）COVID-19症例（上）と非曝露ドナー（下）におけるCD8+T細胞によって認識されるSARS-CoV-2タンパク質の割合。
図S6、S7、および表S6も参照。
・SARS-CoV-2に対する免疫の測定は、COVID19とワクチン開発を理解するための鍵です
・エピトーププールは、回復期のCOVID患者の100％および70％でCD4+およびCD8+T細胞を検出します
・T細胞応答はスパイクだけでなく、M、N、その他のORFにも焦点を当てています
・SARS-CoV-2エピトープに対するT細胞の反応性は、非被曝者でも検出されます
回復した患者からのSARS-CoV-2に対する免疫細胞応答の分析は、標的とするウイルスの領域と、他の一般的な流行するコロナウイルスとの交差反応性も明らかにします。
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